《草原主要毒害草发生规律与防控技术研究》 2016年9月工作简报 - 科研动态 - 西部草原毒害草研究中心

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《草原主要毒害草发生规律与防控技术研究》 2016年9月工作简报

公益性行业(农业)科研专项
《草原主要毒害草发生规律与防控技术研究》
20169月工作简报

根据《公益性行业(农业)科研专项《草原主要毒害草发生规律与防控技术研究》项目任务书安排要求,2016年9月份做了如下工作:
(1)藏橐吾地上部分生物碱专项分离
利用薄层色谱(TLC)、普通柱层析(CC)以及羟丙基葡聚糖凝胶柱层析(Sephadex LH20)等方法,对藏橐吾地上部分碱性氯仿部分进行分离提取。Al 3,0.1 g,以石油醚-丙酮(40:1)+1‰二乙胺进行洗脱,得到10 mg化合物1。Al 6,二氯甲烷-甲醇(1:1)溶解,进行羟丙基葡聚糖凝胶层析柱,洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(1:1),TLC检测合并相似成分,最后得到3个组分。Al 6-3(0.05 g)进行硅胶层析柱,石油醚-丙酮(6:1)+1‰二乙胺进行洗脱,得到8 mg化合物2。Al 7,二氯甲烷-甲醇(1:1)溶解,凝胶层析柱处理,TLC检测合并相似成分,最后得到3个组分。Al 7-2(0.3 g)进行硅胶层析柱,石油醚-丙酮(4:1)+1‰二乙胺进行洗脱,得到10 mg化合物3。将所得化合物放置冰箱冷藏,待进一步对化合物结构进行分析。
(2)疯草内生真菌Undifilum oxytropis分离培养
取新鲜疯草的茎、叶和种子,先用自来水冲洗泥土,再用无菌水清洗,浸泡2 h,随后将样品用75%乙醇漂洗30 s,无菌水冲洗1 min,再用10%次氯酸钠溶液漂洗2 min,无菌水冲洗4次,每次冲洗1 min,取最后一次无菌水冲洗液0.2 mL涂布于PDA培养基上,培养48 h,观察有无菌落长成,据此可验证表面消毒是否彻底。将消毒后的样品用无菌剪刀剪成0.5 mL×0.5 mL的小块,放入PDA培养基,放置在28℃培养箱中培养,1周后,组织边缘有菌丝长出时,用无菌接种环挑出菌丝,接入PDA培养基培养进一步培养。
(3)甘肃棘豆中苦马豆素提取分离
取甘肃棘豆浸膏1 kg用沸水溶解,总体积约2200 mL,用盐酸调pH=2后,加二氯甲烷进行萃取直至清亮。用NaOH浓溶液将浸膏的酸水液调至pH=10,加二氯甲烷进行5次萃取。二氯甲烷萃取后,加入正丁醇萃取,多次萃取,得浸膏57 g;取14 g正丁醇浸膏用甲醇溶解,加入等质量100-200目硅胶拌样,然后将甲醇挥干、研磨;取200-300目硅胶400 g进行湿法装柱,再将样品进行干法上样;洗脱剂为氯仿:甲醇:氨水:水按体积70:26:2:2的比例配制,薄层层析检测洗脱结果,合并含苦马豆素的洗脱成分,挥干后用碱性氯仿处理,最后进行升华,共得苦马豆素16 mg。
(4)醉马芨芨草毒性试验
通过动物实验对醉马芨芨草干草水提液和鲜草水提液的毒性进行检测,结果表明鲜草水提液的毒性大于干草水提液。此外,进行小鼠醉马芨芨草亚慢性毒性试验。购买小鼠108只,雌雄各半,分为三组(对照组、低剂量组、高剂量组),低剂量组鼠粮中醉马芨芨草含量为20%,高剂量组为40%。按每只小鼠每天4g饲喂。
(5)苦豆子总生物碱提取及相关细胞毒性试验
本月主要进行苦豆子总碱的提取,将采集的苦豆子荚果粉碎,分为两组,每组500 g进行工业酒精热回流提取,每组重复7~8次,每次4 h,过滤,收集滤液,旋转蒸发仪除去工业酒精,浓缩成浸膏。目前还在进一步的提取。其次,进行了ROS水平的测定、β-actin的表达以及槐果碱、苦豆碱、氧化苦参碱IC50的测定。本月采用荧光分光光度计重复进行ROS水平的测定,测定结果显示,处理组和对照组差异不显著。根据蛋白定量结果,确定每孔蛋白上样量为20 μg,Marker上样量为3 μL,浓缩胶电压80 V,电泳时间30 min,进入分离胶时电压为120 V,电泳时间100 min,然后经过转膜、5%脱脂奶粉封闭、一抗的孵育、二抗的孵育,最后采用凝胶成像仪发光。采用cck-8还原法进行槐果碱、苦豆碱、氧化苦参碱IC50的测定,目前还在进一步的测定过程中。
(6)潮霉素浓度筛选及分子实验试剂的准备
本月进行了0、1、2、3、4、5 µg/mL等6个浓度的潮霉素浓度筛选试验,进行了3次重复,未出现第一次实验的结果(0、1、2、3 µg/mL等4个浓度有菌生长),分析认为是接种的菌株传代次数较多,活力减弱,导致在含潮霉素的培养基上不生长。另外本月对下一步分子实验所需的试剂进行了准备,并且对内生真菌Undifilum oxytropis总DNA进行了提取,以方便后续分子试验的顺利进行。
(7)赴西藏昌都地区考察天然草地毒害草危害情况
主要通过走访当地管理部门和查阅资料了解昌都地区草原现状、毒害草种类及地理分布。并分别在昌都邦达草原、类乌齐县、贡觉县3地进行实地调查及样品采集。资料显示昌都地区有毒植物种类繁多,分别有毛茛科、龙胆科、罂粟科、玄参科、豆科、瑞香科、蕨类、茄科、菊科有毒植物。其中较常见的为瑞香狼毒、茎直黄芪、黄花棘豆、橐吾、马先蒿等。本次实地调查共采集7种植物,分别为瑞香狼毒、茎直黄芪、斑唇马先蒿、橐吾、黄花棘豆、从生黄芪、马先蒿。其中贡觉县周边草地瑞香狼毒已成为优势种群;邦达草原优势种群为茎直黄芪、斑唇马先和黄花棘豆。
(8)有毒有害植物标本采集
一、为了完善阿拉善毒害植物标本室的有毒有害植物种类,9月5日~8日,项目组深入到阿拉善左旗贺兰山哈拉乌和北寺等地采集有毒有害植物标本,在三天的时间采集射干、遏蓝菜等毒害植物20多种并制作了标本。
(9)工作总结及回顾
根据7月27日西藏《草原主要毒害草发生规律与防控技术研究》现场观摩会的要求,对内蒙古地区毒害草防控示范基地建设情况进行了梳理和回顾,经过细致的工作,写出了毒害草防控示范基地建设,毒害草人工种植、草地恢复和生物多样性、毒害青贮利用等方面取得在成果进行了全面系统的总结,同时提出了存在的问题不足以及意见和建议,为项目的顺利验收打下了良好的基础。
(10)收购黄花棘豆为完善饲料利用提供基础
9月份在青海省湟中县土门关乡收购黄花棘豆2000kg,收购的黄花棘豆将采用工业酒精浸泡提取粗提取物,粗提取物作为后续研究,提取后剩余的黄花棘豆经晾干后加入到饲料中给放牧羊作为冬季补料,观察黄花棘豆提取毒性成分后残渣对放牧羊的饲喂效果。目前已完成黄花棘豆收购、晾干、粉碎等前期处理工作,工业酒精浸泡提取粗提取物工作将在2016年10月份进行。
(11)醉马草有毒生物碱的脱毒
继续进行醉马草有毒生物碱的脱毒方法的试验,动态观测醉马草青贮中微生物的数量和种类。对青贮0、1、3、5、7、9天等醉马草样品进行预处理,为检测其有毒生物碱做准备。将物理、化学和微生物方法处理过的醉马草按照实验要求粉碎,已送往中国科学院进行营养成分含量的检测,有毒生物碱检测待送样中。
(12)整理历年来醉马草防控试验数据,对比分析各种物理、化学、生物防控处理后的群落年度和季节动态,进行综合评价,总结最佳防控方式,集成防控技术。
(13)继续协助乌鲁木齐市畜牧水产草原站对乌鲁木齐各区(县)开展草原毒害草监测及调查工作进行指导,完成外野调查工作,陆续进行内业整理工作,包括标本鉴定、图件编绘、调查报告编写等工作的指导。
(14)召集项目团队成员,进行项目总结工作的相关任务部署。全面开展项目的试验数据、技术集成、示范基地、培训及推广、培养人才、发表论文和著作等成果;并协调财务部门进行项目经费总结。
(15)继续进行黄花棘豆发生规律研究,明确化学防控措施对黄花棘豆种子库的影响,以了解采取化学防控措施后黄花棘豆依靠种子萌发恢复种群数量的潜力,为草地毒害草的防控提供参考。
(16)继续撰写相关论文,投稿《中国草地学报》1篇,《新疆农业科学》录用1篇。
 

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